атомно абсорбционное определение меди в биологических образцах

Пытаясь определить, ответственны ли частицы на основе меди или ионы меди, которые они выделяют в водной среде, за определения антимикробной активности необходимо тщательно учитывать ряд аспектов. Во-первых, при проведении стандартных бактериологических анализов общее воздействие частиц или растворимой меди определяется взаимодействием между временем и скоростью растворения частиц. Во-вторых, химический состав меди сложен. При типичных биологических (близких к нейтральным) значениях рН частицы могут образовываться при добавлении "растворимых" солей в фазу раствора в результате образования оксо–гидроксидов, полимеризации, сшивания и осаждения (Paulson and Kester, 1980; Zhang and Richardson, 2016). Наконец, частицы, образовавшиеся случайно или специально добавленные в жидкую фазу, могут агломерироваться и/или агрегировать. Таким образом, отсутствуют исследования, позволяющие точно определить, какие бактерии испытывают воздействие частиц на основе меди и, следовательно, какая химическая форма является активной
Определение антибактериальной активности проводили классическим методом дисков и методом колодцев на образцах коллекции института микробиологии и иммунологии имени Мечникова И.И., где в качестве тест культур использовали Staphylococcus aureus 124 и Pseudomonas aeruginosa 18.
Приготовление микробной суспензии штаммов (микроорганизмов) проводили с использованием прибора Densi-La-Meter (производство PLIVA-Lachema, Чехия; длина волны 540 нм). Микробную суспензию штаммов готовили следующим образом: синхронизацию культур штаммов проводили с использованием низкой температуры (4 оС). Микробная нагрузка составляла107 микробных клеток на 1 мл среды и устанавливалась по стандарту McFarland. В опытах использовали 18-24 часовую культуру штаммов микроорганизмов. Для культивирования использовали агар Мюллера-Хинтона.
Определение противомикробной активности исследуемых образцов проводили на двух слоях плотной питательной среды, разлитой в чашки Петри (диаметром 100 мм и высотой 15 мм). В нижнем слое использовали "голодную" незасеянную среду (агар-агар, вода, соли). Этот слой представляет собой подложку из среды объемом (10,0 ± 0,3) мл, на которую строго горизонтально устанавливают 6 тонкостенных цилиндров из нержавеющей стали диаметром 8 мм и высотой 10 мм. Вокруг цилиндров заливают верхний слой, состоящий из питательной агаризованной среды, расплавленной и охлажденной до температуры (40,0 ± 0,5) °С, в которую вносили соответствующий стандарт суточной тест-культуры микроорганизма. Предварительно верхний слой хорошо перемешивался до образования однородной массы. После застывания цилиндры стерильным пинцетом извлекали и в образовавшиеся лунки помещали исследуемые образцы в объеме 0,3 мл. Объем среды для верхнего слоя составлял (15,0 ± 0,5) мл. Чашки подсушивали 30 - 40 минут при комнатной температуре и ставили в термостат на 18 - 24 часа. Диаметры зон задержки роста микроорганизмов замеряли с помощью мерной линейки с точностью измерения 1,0 мм.
При оценке антибактериальной активности исследуемых образцов применяли следующие критерии:
- отсутствие зон задержки роста микроорганизмов вокруг лунки, а также зоны задержки до 10 мм указывает на то, что микроорганизм не чувствителен к внесенному в лунку препарату или концентрации антимикробного вещества;
- зоны задержки роста диаметром 10 - 15 мм указывают на малую чувствительность культуры к испытуемой концентрации антимикробного вещества;
- зоны задержки роста диаметром 15 - 25 мм расцениваются, как показатель чувствительности микроорганизма к испытуемым субстанциям;
- зоны задержки роста, диаметр которых превышает 25 мм, свидетельствует о высокой чувствительности микроорганизмов к испытуемой концентрации субстанции.
В источнике упоминается, что для определения антибактериальной активности наночастиц меди (CuNPs) можно использовать различные методы, включая диффузионный тест на диске, минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) и минимальную бактерицидную концентрацию (MBC) [4]. На засеянную соответствующим микроорганизмом поверхность агара накладывали диски диаметром 3 мм предварительно смоченным в растворе испытуемого образца или накладывали небольшое количество биомассы микроводорослей. При оценке антибактериальной активности исследуемых экстрактов и их модификаций применяли следующие критерии:
- отсутствие зон задержки роста микроорганизмов вокруг диска, указывает на то, что микроорганизм не чувствителен к препарату или концентрации антимикробных субстанций;
- зоны задержки роста диаметром 5-8 мм указывают на малую чувствительность культуры к испытуемой концентрации антимикробного вещества;
- зоны задержки роста диаметром 9 - 14 мм расцениваются, как показатель чувствительности микроорганизма к концентрации испытуемого вещества;
- зоны задержки роста, диаметр которых превышает 15 мм, свидетельствует о высокой чувствительности микроорганизмов к испытуемой концентрации антимикробного вещества.

1.2. Способы получения образцов тонкослойной металлизированной меди.
Медное покрытия наносили на ткань, напряжение на разряде магнетронной распылительной системе составляло 600 В, при токе разряда 10 А и вакууме в камере нанесения 8х10-2 Па. Была получена ткань со слоем меди 3мкм, размеры образцов 1,0х0,6 м2. Толщину медного покрытия определяли с помощью интерферометра Линника на образцах-свидетелях, которые размещались в зоне нанесения покрытия. Внешний вид ткани с медным покрытием отличался от исходной ткани (рис.1. I).
Микроструктура медного покрытия исследовалась с помощью сканирующего растрового электронного микроскопа РЭМ-101 ( рис.1. II).



Рисунок 1 - Микроструктура медного покрытия: I - внешний вид тканевой основы (а), на которую нанесен слой меди толщиной 3 мкм; II - изображение рельефа поверхности металлизированной ткани с медью при различных увеличениях (а – х 99.9, b – х 179, c – х 842, d – х1.56k)
Определение антибактериальной активности металлизированной медью ткани проводили, как уже было описано, а в качестве контрольного варианта использовали ту же ткань без нанесения меди.

1.3. Способ получения хелатной формы меди в клетках микроводорослей Dunaliella viridis
Для определения зависимости антибактериальной активности ионной формы меди и хелатной формы меди дополнительно внесено в гомогенаты клеток Dunaliella сернокислую медь до конечных концентраций 1, 7, 15 г/л. Культуру перемешивали и выдерживали в течение 30 мин. После этого суспензию клеток гомогенизировали, образцы центрифугировали при 6000 g в течение 15 мин при комнатной температуре. В осадках фрагментов клеток и полученной водной фазе, после осаждения фрагментов клеток определяли содержание меди на атомно-адсорбционном спектрофотометре iСЕ3500, как описано в работе (Юрченко и др., 2024) а в аликвотах антибактериальную активность по отношению к Staphylococcus aureus 124 и Pseudomonas aeruginosa 18.
С целью определения изменения степени экстрактивности компонентов микроводорослей после внесения сернокислой меди определяли спектры поглощения водорастворимых компонентов на спектрофотометре Shimadzu UV-2600 при длинах волн 200-400нм.
При оценке антибактериального действия ионов меди использовали водный раствор сернокислой меди в концентрации в концентрациях: 0,25, 0,5, 1,0, 7,0 15,0 20,0 и 25 г/л, которая тестировалась на антибактериальную активность к двум видам бактерий, как уже было описано.
Электропроводность образцов измеряли на векторном сетевом анализаторе Rohde & Schwarz ZNB40.
Все эксперименты повторялись не менее трех раз, при нескольких аналитических повторностях. Полученные результаты подвергались статистической обработке результатов с использованием пакета программ Statistica 5.0. В таблицах и графиках приведены средние значения с их стандартными ошибками.

Практическая часть.
Результаты исследования
2.1. Устойчивость Staphylococcus aureus 124 и Pseudomonas aeruginosa 18 к ткани с напылением тонкого слоя меди (3 мкм).
В данном исследовании был применен антибиотик меропенем – противомикробное средств системного действия, который ингибирует синтез компонентов клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий путем связывания с белками РВР (те же белки, которые связывают пенициллин).
Показано, что меропенем при тестировании на двух разных видах бактерий, обеспечивал задержку роста для Staphylococcus aureus 124, которая составляла 24,9 +0,5 мм при использовании теста бумажных дисков (рис.2 А). В то же время, этот антибиотик не ингибировал рост Pseudomonas aeruginosa 18, что проявлялось в отсутствии задержки роста этой бактериальной культуры (рис.2 А).

Рисунок 2 - Зоны задержки роста Staphylococcus aureus 124 (1) и Pseudomonas aeruginosa 18 (2) при тестировании методом бумажных дисков антибиотика меропенема (А), а также ткани с нанесенным слоем меди толщиной 3мкм (В). Представлены средние значения из 3- 5 экспериментов и их стандартные ошибки. * отмечены различия между антибиотиком и тканью для вариантов у которых Р < 0,05 по сравнению с меропенемом.

Таким образом, меропенем проявляет выраженную антибактериальную активность по отношению к Staphylococcus aureus 124 не влияя на Pseudomonas aeruginosa 18. Полученные результаты подтверждают наличие выраженной видовой бактериальной чувствительности к действию этого антибиотика.
Ткань на которой был нанесен слой меди в 3 мкм обеспечивала задержку роста Staphylococcus aureus 124 на 21,2 мм, что составляло 85 % по сравнению с меропенемом и является показателем высокой чувствительности этой культуры к действию меди, нанесенной на ткань (рис.2 В).
Ткань с тонким слоем меди подавляла рост не только Staphylococcus, но и Pseudomonas, в отличие от антибиотика, хотя и в меньшей степени, только на 50,2 % по сравнению с антибиотиком для Staphylococcus aureus 124 (рис.2 В). Следовательно, тонкий слой меди, нанесенный на ткань, проявлял выраженную антибактериальную активность по отношению к Staphylococcus, так и слабо выраженную активность к Pseudomonas.