БИОТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СВЕРХПРОДУЦЕНТОВ

БИОТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СВЕРХПРОДУЦЕНТОВ
Рекомбинантная ДНК представляет собой ДНК, которую получают как результат объединения молекулы векторной ДНК, обладающей способностью к репликации в определенной клетке-хозяине. Данная ДНК кодирует продукт, синтез которого необходимо осуществить в этой клетке-хозяине. Векторы для получения рекомбинантных ДНК могут быть нескольких видов:
• плазмидные;
• вирусные;
• искусственные хромосомы на основе дрожжевых или животных хромосомных элементов.
Существует большой набор различных систем, позволяющих осуществлять экспрессию генов в бактериях, дрожжах и других организмах, включая клетки человека.
Наиболее распространённые векторы, которые используются для получения рекомбинантных ДНК представлены плазмидами – двухцепочечными кольцевыми структурами ДНК, размером от 1000 до нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Общую схему получения рекомбинантных ДНК с использованием плазмидных векторов можно представить следующим образом:
• выделение нужного (целевого) гена;
• встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);
• введение вектора в организм-продуцент, например, E. coli;
• идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены для формирования банка клеток.
Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК, оставляя лишь жизненно необходимые фрагменты, такие как промоторы, регуляторы и т.д.
Промоторы представляют собой последовательности ДНК, расположенные перед началом структурного гена и определяющие степень активности РНК- полимеразы. Выбор промотора имеет особое значение при создании генетически модифицированных конструкций. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспечить активность любого гена, в том числе и эукариотического, но лишь в прокариотическом организме. В эукариотическом организме может работать только ген, который имеет эукариотический промотор.
Промотор может быть сильным и слабым. Сильный промотор инициирует синтез мРНК часто, слабый - намного реже. При этом очень важно при конструировании вектора не изменить последовательность оснований промотора, которая определяет частоту инициации синтеза мРНК. Замена одного основания в этой последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в 1000 раз.
Регуляторные промоторные системы подразделяются на:
а) конститутивные - действующие во всех тканях организма. К наиболее сильным для экспрессии в растениях конститутивным промоторам относится 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (p35SCaMV). Он функционирует в течение всей жизни растения во всех растительных тканях;
б) специфические - действующие в определенных тканях. Например, промоторы, которые контролируют экспрессию в клетках на определенных стадиях роста и развития растения или работают только в фотосинтезирующих тканях (промотор гена малой субъединицы фотосинтетического фермента рибулозо-бисфосфат- карбоксилазы [рРБФК]);
в) индуцибельные - работающие при определенных условиях: температура, освещение, концентрация фитогормонов и т.д., например, промотор эндопептидазы, салицилат-индуцируемый промотор. Такие промоторы используются в тех случаях, когда исследователь ставит задачи достичь тонкой регуляции активности трансгенов в пространстве (в определенных тканях) и времени (в определенный период развития). Многие из таких промоторов достаточно универсальны, например, некоторые промоторы генов теплового шока. В зависимости от типа промотора, индукторами могут служить дексаметазон, тетрациклин, этанол, бензотиадиазол, ионы меди и другие соединения. Они перспективны для биотехнологии, так как позволяют вызвать в заданный период экспрессию гена, когда она уже либо не препятствует нормальному росту и развитию продуцента, либо не вызывает иных отрицательных последствий.
Терминаторы. В векторе должна обязательно присутствовать нуклеотидная последовательность, расположенная на З’-конце трансгена, отвечающая за остановку процессов, запущенных промоторами. Добавление терминаторов транскрипции предотвращает нежелательное прохождение через трансген РНК-полимеразы, если промотор хозяйского генома случайно оказывается поблизости от места встраивания.
Другие элементы. Кроме промотора, экспрессию чужеродных генов могут регулировать другие элементы, к примеру, модуляторы, а также энхансерные последовательности, которые действует независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК. Они расположены на расстоянии от одного до нескольких сотен нуклеотидов до промотора.
Для получения подходящего вектора применяют специальные ферменты - рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК «разрезаются» в разных местах, в результате может образовываться два типа концов цепей ДНК: «липкие» и «тупые». «Тупые» концы образуется при воздействии рестриктазами на один и тот же участок обеих цепей, при котором «разрез» происходит в одном и том же месте на обеих цепях ДНК. В то время как «липкие» концы образуются, когда «разрез» происходит в разных местах, обычно расстояние составляет 3-10 нуклеотидов. Наиболее удобны для использования именно «липкие» концы, так как они позволяют организовать специфическое связывание вектора и встраиваемого гена, путем создания «липкого» конца, который комплементарен «липкому» концу вектора.
Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирную связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т.е. ДНК, содержащая новую комбинацию последовательностей (или генов).
После получения вектора необходимо ввести его в клетки, способные его продуцировать и получить небольшой объем культуры. Затем необходимо провести скрининг тех клеток, которые получили именно необходимый вектор, так как даже при правильно подобранном и проведенном клонировании не все вектора получают целевой ген, соответственно рекомбинантный вектор попадает не во все клетки.
Для этого полученную культуру клеток рассеивают на агаризованную среду, содержащую антибиотик, ген резистентности к которому есть в рекомбинантном векторе (например, среда LB-agar-amp, если присутствует ген резистентности к ампициллину). Далее есть два варианта скрининга, которые могут быть использованы:
1. Бело-голубая селекция. Используется, если в векторе есть ген LacZ, который кодирует фермент, сбраживающий лактозу. В агаризованную среду добавляют IPTG и X-Gal, который является искусственным аналогом лактозы, продукты расщепления которого имеют синий цвет. IPTG является индуктором запуска транскрипции. Векторная плазмида должна быть построена таким образом, что при удачном встраивании целевого вектора нарушается структура гена LacZ, что приводит к тому, что клетки не расщепляют X-Gal и не окрашиваются в синий цвет. Такой скрининг не является универсальным и не всегда обеспечивает необходимую точность.
2. ПЦР-скрининг. Наиболее точный вид скрининга. Для его использования подбираются специальный праймеры, с двух сторон от целевого гена, но за его пределами в векторе. Таким образом, если ген встроился, то после ПЦР на электрофорезе будет наблюдаться фрагмент с геном, длина которого будет заранее известна (и обычно она больше, чем фрагмент без вставки). Таким образом можно легко отделить те колонии, которые содержат целевой вектор.
Современные методы генной инженерии позволяют получить сверхпродуценты, в которых продукт клонированного гена составляет от 10 до 50% растворимых белков. Важнейшими факторами, которые следует принимать во внимание при получении сверхпродуктов, являются вид