Синтез пептидов на твёрдом носителе

Введение

Актуальность темы. Пептидный синтез — это построение линейной пептидной цепи путем соединения аминокислот с помощью химических методов. Обычно речь идет о получении пептидов, содержащих не более 40-50 аминокислотных остатков, таким способом можно осуществить также синтез небольших молекул белков.
Сложности синтеза пептидов связаны с необходимостью обеспечения строго определенной последовательности аминокислот и созданием условий, препятствующих их рацемизации.
Учитывая функциональность аминокислот, даже в простейшем случае сочетания двух аминокислот, например аланина и валина, возможно получение четырех разных дипептидов: Ала-Вал, Вал-Ала, Вал-Вал, Ала-Ала. Естественно, что число возможных сочетаний будет возрастать с увеличением количества соединяемых аминокислот. Кроме того, требуются специальные методы, обеспечивающие заданную последовательность аминокислот в пептиде. В общем случае синтез любого пептида включает три основные стадии:
1) защита (блокирование) не участвующих в образовании пептидной связи функциональных групп;
2) активирование карбоксильных групп, образующих амидную связь, и их конденсация с аминогруппой другой аминокислоты;
3) удаление защитных групп для продолжения синтеза или выделения свободного пептида.
Пептиды используются для получения эпитоп-специфических антител, картирования эпитопов антител и сайтов связывания ферментов, а также для разработки новых ферментов, лекарств и вакцин. В то время как синтез пептидов раньше был трудоемким и давал низкие выходы, улучшенные методы производства и пептидная химия сделали синтез пептидов более доступным для общих исследовательских целей.
Цель работы - рассмотреть синтез пептидов на твёрдом носителе.
Задачи работы:
- рассмотреть защитные группы в пептидном синтезе;
- рассмотреть процесс снятия защиты и гидролиз.


























1. Защитные группы в пептидном синтезе

Синтез пептидов характеризуется образованием пептидной связи между двумя аминокислотами. Хотя окончательного определения пептида не существует, обычно он относится к гибким (небольшим вторичным структурам) цепям, состоящим из 30-50 аминокислот.
«Способность образовывать пептидные связи для связывания аминокислот существует уже более 100 лет, хотя первые синтезированные пептиды, в том числе окситоцин и инсулин, появились только через 50-60 лет, что свидетельствует о сложной задаче химического синтеза цепей аминокислот» . За последние 50 лет достижения в области химии и методов синтеза белка достигли такой степени, что сегодня синтез пептидов является обычным подходом даже в высокопроизводительных биологических исследованиях и разработке продуктов и лекарств.
Преимущество современных стратегий синтеза пептидов заключается в том, что, помимо возможности создавать пептиды, которые обнаруживаются в биологических образцах, можно использовать творческий подход и воображение для создания уникальных пептидов для оптимизации желаемой биологической реакции или другого результата.
Твердофазный синтез пептидов предложен Р. Б. Меррифилдом из университета Рокфеллера (Нобелевская премия 1984 г.). Этот метод основан на сборке пептида на нерастворимой полимерной подложке последовательным присоединением остатков аминокислот с защищенными α -амино- и боковыми группами. План состоял в том, чтобы собирать пептидную цепь постадийно, причем во время синтеза цепь должна быть одним концом привязана к твердому носителю. В результате выделение и очистка промежуточных и целевых производных пептидов сводились просто к фильтрованию и тщательной промывке твердого полимера для удаления всех избыточных реагентов и побочных продуктов, остающихся в растворе.
«Термин твердофазный (solid-phase) относится скорее к физическим характеристикам вещества на носителе, так как химическая реакция на полимерном носителе протекает в одной фазе — в растворе. В подходящем растворителе полимер набухает, превращаясь в мало вязкий, но сильно структурированный гель (сшитые полимеры), или же растворяется (в случае не сшитых полимеров), и процесс синтеза происходит на ультрамикрогетерогенном уровне, в практически гомогенной системе» .
Для твердофазного органического синтеза требуется полимерная основа — смола S, к которой прикреплен линкер L. На первой стадии к линкеру присоединяют молекулу субстрата А. Молекула А иммобилизуется (т.е. перестает быть мобильной), но сохраняет способность реагировать с другим реагентом В (стадия 2).
Продукт АВ остается на смоле, что позволяет отделить его от избытка реагента В (и побочных продуктов) простым промыванием. (Можно добавлять все новые реагенты, последовательно усложняя исходный субстрат А, главное чтобы линкер в этих реакциях оставался неизменным). Бифункциональный линкер L подбирается так, чтобы его связь со смолой S была более прочна, чем с субстратом А. Тогда на последней стадии целевое соединение AB можно отделить от смолы, разрушив его связь с линкером. Понятно, что связь L–AB должна расщепляться в мягких условиях, не повреждая ни само соединение (связь А–В), ни контакт линкера со смолой (связь L–S).
Таким образом, в идеальном случае, промывая смолу после каждой стадии и расщепляя связь с носителем, получают чистое вещество. Естественно полагать, что применение большого избытка реагентов и последующее отделение от смолы во многих случаях позволяют сдвигать химическое равновесие в сторону образования целевого продукта и сократить время синтеза. К недостаткам твердофазного органического синтеза можно отнести необходимость использования достаточно большого избытка (2—30 эквивалентов) реагентов, сложности при идентификации промежуточных продуктов синтеза, а также сравнительно высокую стоимость модифицированных полимерных носителей, которая определяется стоимостью линкера.
«Основная проблема при синтезе пептидов  проблема защиты аминогруппы. При взаимодействии карбоксильной группы одной аминокислоты с аминогруппой другой кислоты необходимо исключить возможность протекания реакции между карбоксильной группой и аминогруппой молекул одной и той же аминокислоты» .
Стадия 1. Иммобилизация N-защищенной аминокислоты на полимерный носитель.
Первой стадией схемы является иммобилизация аминокислоты на полимерный носитель. Для того чтобы избежать таких побочных процессов, как образование олигопептидов, аминокислоту предварительно защищают. Как правило, используют N-защищенные аминокислоты, и образующаяся связь между аминокислотой и носителем является связью амидного или сложноэфирного типа.
Наиболее часто применяемыми защитами аминогруппы в твердофазном органическом синтезе являются защитные группы карбаматного типа трет-бутоксикарбонильная (Boc) и 9H-флуоренилметоксикарбонильная защита (Fmoc), X — защищаемая группа:





Иммобилизация Fmoc-аминокислот на полимерный носитель Ванга (X=O) с образованием сложноэфирноголинкера бензильного типа осуществляется карбодиимидным методом при помощи диизопропилкарбодиимида (DIC) в присутствии 4-(диметиламино)пиридина (DMAP) в качестве катализатора. Реакция иммобилизации со стерически незатрудненными аминокислотами протекает при комнатной температуре. Иммобилизация стерически затрудненных аминокислот требует проведения реакции при 40—60 °С в течение 2-х дней и повторного проведения иммобилизации. Иммобилизация Fmoc-аминокислот на полимерный носитель Ринка (X=NH) с образованием амидного линкера бензгидрильного типа осуществляется в присутствии реагента Кастро (1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси) трис-(диметиламино)фосфония гексафторфосфата (BOP), основания диизопропилэтиламина (DIEA) и 1-гидроксибензотриазола (HOBt), в качестве катализатора. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 2 ч для стерически незатрудненных и 4—6 ч в случае стерически затрудненных аминокислот.
Необходимо отметить, что выбор защитной группы определяется используемым типом полимерного носителя. Условия иммобилизации защищенных аминокислот различны для различных типов полимерных носителей. Иммобилизация Boc-аминокислот на смолу Меррифильда, представляющую собой хлорметилированный полистирол, проводится in situ в виде цезиевых солей при добавлении суспензии карбоната цезия в диметилфталате (DMF) и каталитических количеств йодида калия.