Эрлихиоз собак

Введение

Впервые эрлихиоз у собак был обнаружен в Алжире в 1935 году Позднее исследования Пауля Эрлиха в 1945 году показали отличия новых организмов от других внутриклеточных агентов [1]. Обнаруженные микроорганизмы были названы в его честь. Большое внимание данное заболевание привлекло во время войны во Вьетнаме, когда американские войска потеряли порядка 300 военных собак [2, 3]. Самые активные исследования эрлихиоза начались в 1987 году после того, как была доказана их опасность для человека.
В связи с тем, что основные переносчики данного заболевания – коричневые собачьи клещи Rhipicephalus sanguineus предпочитают теплый климат, заболевание наиболее распространено в регионах с тропическим и субтропическим климатом [2, 3, 4, 5]. Однако в последнее время наблюдается распространение клещей и за пределы этих регионов [4, 5]. Распространенность эрлихиоза показана во многих странах Африки, Азии, Ближнего Востока, Европы. Наибольший процент наблюдается в странах Средиземноморья, однако в связи, в первую очередь, с путешествиями людей с питомцами, а также импортом собак и глобального потепления, возбудители заболевания начали активно мигрировать и приспосабливаться к обитанию в более северных районах, что привело к возникновению новых очагов в странах, где ранее данная болезнь не наблюдалась.
 
Основная часть

1 Характеристика возбудителя

Выделяют два вида эрлихиоза собак: моноцитарный (поражающий моноциты) и гранулоцитарный (поражающий нейтрофилы). Возбудителем первого являются Ehrlichia canis и Ehrlichia chaffensis, второго – E. Phagocytophila и E. Platus. Они относятся к типу Proteobacteria, класс Alphaproteobacteria, отряд Rickettsiales, семейству Anaplasmataceae, род Ehrlichia.
Эрлихии – это грамотрицательные кокковидные плеоморфные облигатные внутриклеточные агенты. Их размер в среднем составляет 0,5-1,5 мкм (до 4 мкм перед делением). Они паразитируют внутри вакуолей (фагосом) моноцитов хозяина в виде образований, называемых морулами (их размер составляет от 2 до 5 мкм), которые при окрашивании по Романовскому-Гимзе дают синий цвет [6, 8]. Плохо окрашиваются анилиновыми красителями, удерживают основной фуксин, окрашиваются по Здродовскому карболовым фуксином. Бактерии неподвижные, спор и капсул не образуют [9]. Размножаются бинарным делением вегетативных форм.
Важной особенностью строения эрлихий является отсутствие таких важных компонентов клеточной мембраны, как липополисахариды и пептидогликаны [8]. Однако при этом их клеточная стенка богата холестерином, который является производным клеток хозяина. Его роль заключается в облегчении проникновения в клетки млекопитающих и повышении шансов на выживании эрлихий [8]. Методом электронной микроскопии было установлено, что наружная мембрана волнообразной формы отстает от гладкой цитоплазматической.
Клетки представлены двумя морфологическими формами:
- ретикулярные клетки большего размера, для которых характерно равномерное распределение рибосом и наследственного материала;
- мелкие клетки, в которых рибосомы и нуклеоид расположены плотно в сердцевине.
Первая форма свойственна периоду роста и развития этого микроорганизма, вторая – стационарному периоду покоя [9].
Выход эрлихий из клеток сопровождается разрывом эндосомы, а затем – клеточной стенки инфицированной эукариотической клетки. В некоторых случаях происходит экзоцитоз эрлихий или инфицированных вакуолей из клетки-хозяина [10].
Электронные микрофотографии показывают внешний слой аморфного материала – микрокапсулу толщиной 10-15 нм, далее следует трехслойная мембрана клеточной стенки шириной 8-12 нм [11]. Цитоплазма образована рибосомоподобными гранулами, между которыми расположены нити ДНК




 
2 Культуральные свойства возбудителя

Эрлихии не способны расти на питательных и в куриных эмбрионах. Для их культивирования применяют культуры собачьих макрофагов или эпителиоподбных перевиваемых культур, таких как VERO, HeLa, ЛЭЧ, эндотелиальные клетки человека [9]. Культивирование эрлихий трудоемко и занимает длительное время в связи с тем, что накопление микроорганизмов в этих клетках незначительно. Для размножения некоторых видов эрлихий могут быть использованы белые мыши. Наиболее успешные результаты получены при культивировании эрлихий в клеточных линиях DH82 (гистоцитома собак) и HL-60 (лейкемия человека).
Культура клеток DH82 получена от десятилетнего золотистого ретривера [13]. Образец костного мозга был взят с проксимального отдела бедра и помещен в среду Mac’Coys5, дополненную 20% эмбриональной бычьей сывороткой, 1,0 М натрия бикарбонатом, 4 мМ L-глутамином, 0,2 М незаменимых аминокислот, 0,1 М заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия и по 250 г/л гуанидина, уридина, цитидина и аденозина. Клетки диссоциировали энергичным перемешиванием, полученную суспензию переносили в 25 см2 колбы для тканевых культур и культивировали при 370С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Культуры изначально поддерживались за счет двухнедельной половинной смены среды. Большинство клеток быстро прилипали, неадгезивные клетки удаляли со средой. Когда прикрепившиеся клетки образовывали монослой, культуры трипсинизировали и еженедельно пассивировали. Культивированные клетки периодически замораживали в среде с добавлением 10% диметилсульфоксида и хранили в жидком азоте.
После нескольких месяцев культивирования клетки были перенесены в 75 см2 колбы и адаптированы к росту путем еженедельного пассивирования в минимальной эссенциальной среде Игла, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1,0% L-глутамина и 1,0% антибиотиков.
Клетки данной линии растут в виде монослоя. Они крупные, одиночные, размером от 25 до 55 мкм. Цитоплазма обильная, базофильная, содержит вариабельное количество эозинофильных гранул неправильной формы, цитоплазматических вакуолей и цитоплазматических псевдоподий. Ядрышки крупные, неправильной формы. Также цитоплазма содержит большое количество митохондрий и хорошо развитый шероховатый эндоплазматический ретикулум. Иногда встречаются лизосомы и вакуоли.
Клетки DH82, инфицированные E. Canis, содержат в герметичных колбах объемом 25 см3 при температуре 320С на воздухе окружающей среды в 5 мл среды L-15B с добавлением 10% триптозофосфатного бульона, 5% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 0,1% концентрат бычьих липопротеинов (MP Biomedicals), 0,1% NaHCO 3 и 10 мМ HEPES, но без антибиотиков (ECM) с еженедельной сменой среды [12].