Методы изучения клеток: проточная цитофлуориметрия (принцип метода, анализаторы, сортировщики, фенотипирование клеток, анализ состояния и функций клетки).

Введение

Проточная цитофлуориметрия – это один из наиболее точных и информативных методов для изучения клеток, широко используемый в биологии, медицине и биотехнологии. Данный метод позволяет детально анализировать физические и химические свойства клеток или частиц, проходящих в потоке жидкости через лазерный луч. Она обладает высокой разрешающей способностью и возможностью одновременно анализировать множество параметров, что делает ее незаменимой в исследованиях клеточного фенотипа, а также для диагностики и мониторинга ряда заболеваний. С помощью этого метода можно проводить фенотипирование клеток, оценивать их функциональную активность, а также выполнять сортировку клеток на основе заданных характеристик.
1. Основы проточной цитофлуориметрии и принципы метода

История и развитие метода проточной цитофлуориметрии (ПЦФ) уходят корнями в середину 20-го века, когда возникли первые исследования в области анализа отдельных клеток в потоке жидкости. В 1950-х годах были заложены основы технологии, использующей лазерный свет и флуоресцентные метки для изучения физических и химических свойств клеток. Первоначальные попытки включали использование методов микроскопии и детектирования флуоресценции, однако эти подходы обладали ограниченной чувствительностью и не позволяли анализировать большие объемы клеток.
Прорывом в развитии метода стало создание в 1960-х годах первых автоматизированных анализаторов, способных фиксировать характеристики клеток в потоке. В этот период были усовершенствованы технологии обработки сигнала, что позволило исследователям не только различать клетки по размеру и форме, но и оценивать их флуоресцентные характеристики. Уже в 1970-х годах появились коммерчески доступные модели цитофлуориметров, которые стали востребованы в научных лабораториях и медицинских центрах. Эти устройства были способны анализировать до нескольких тысяч клеток в секунду, что сделало метод незаменимым для массовых анализов клеточной популяции.[5]
2. Оборудование для проточной цитофлуориметрии и его возможности

Важным аспектом проточной цитофлуориметрии является понимание устройства и принципа работы самого оборудования, которое используется для анализа клеток.
Оборудование состоит из нескольких ключевых компонентов: источников лазерного света, системы оптики для фокусировки и направления света, детекторов, а также системы для управления потоком клеток и сбора данных. Каждое из этих элементов выполняет свою функцию, что позволяет обеспечить точный и быстрый анализ клеточных популяций.[4]
На рисунке 3 представлена схема оборудования для проведения проточной цитометрии, где показаны основные компоненты устройства и их взаимодействие в процессе анализа клеток.
Один из ключевых компонентов системы проточной цитофлуориметрии — это гидрофокусирующая система, которая отвечает за обеспечение стабильного и равномерного потока клеток. В гидрофокусирующей системе клетки сжимаются в узкий поток с помощью потока жидкости, что позволяет подавать клетки в лазерный световой пучок поочередно, избегая их столкновения друг с другом. Это критически важно для обеспечения качественного измерения каждой клетки в потоке.
Рисунок 4 иллюстрирует принцип работы гидрофокусирующей системы, показывая, как поток жидкости фокусирует клетки для оптимального их анализа в проточной цитофлуориметрии.
Цитофлуориметры, используемые в проточной цитофлуориметрии, можно разделить на два основных типа: анализаторы и сортировщики. Оба типа приборов служат для анализа клеток, но их функциональные возможности и область применения различаются.
Анализаторы представляют собой устройства, которые выполняют количественный и качественный анализ клеток, проходящих через световой поток. Эти приборы фиксируют рассеяние света, флуоресценцию и другие параметры клеток, передавая данные в компьютерную систему для обработки. В отличие от сортировщиков, анализаторы не отделяют клетки друг от друга, а лишь регистрируют их характеристики, что позволяет провести исследование популяции клеток в целом. Основное назначение анализаторов — это получение информации о клеточных параметрах, таких как размер, гранулярность, уровень флуоресценции, что позволяет исследовать клеточную гетерогенность, определять типы клеток и их функциональные состояния. В современных моделях анализаторов можно использовать несколько лазеров и флуоресцентных каналов, что расширяет диапазон исследуемых клеток и молекул.
Сортировщики, в свою очередь, представляют собой более сложные устройства, которые не только анализируют клетки, но и способны разделять их по заранее определённым признакам. Этот процесс, известный как клеточная сортировка, осуществляется путём применения электрических или магнитных полей, которые направляют клетки в разные контейнеры в зависимости от их характеристик. Сортировщики широко применяются для выделения клеток с определёнными маркерами или состояния, таких как иммунные клетки с определёнными рецепторами или опухолевые клетки, для последующего анализа или использования в исследовательских и терапевтических целях. Это дает возможность проводить более точечный анализ и использовать клеточные популяции для дальнейших экспериментов или терапевтических процедур.
3. Применение проточной цитофлуориметрии в клеточных исследованиях

Фенотипирование клеток с помощью проточной цитофлуориметрии является мощным инструментом для изучения клеточных популяций и их характеристик, таких как морфология, размер, сложность и экспрессия различных молекул, включая клеточные маркеры. Этот метод позволяет исследовать большое количество клеток одновременно, что делает его особенно полезным для анализа сложных клеточных популяций в различных биологических и медицинских исследованиях.
Проточная цитофлуориметрия использует флуоресцентные метки, которые связываются с определёнными клеточными маркерами — белками, углеводами или другими молекулами на поверхности клеток. Эти маркеры служат индикаторами специфических клеточных состояний или функций, таких как активация определённых рецепторов, дифференциация клеток или наличие определённых молекул, связанных с заболеванием, например, раковыми маркерами. Флуоресцентные метки могут быть назначены с помощью антител, которые связываются с конкретными молекулами клеточной поверхности, а затем излучают свет при возбуждении лазером, что позволяет определить количество и характер клеток, содержащих эти маркеры.[10]
Фенотипирование клеток с помощью этого метода предоставляет возможность не только количественно оценить клеточные популяции, но и изучить их гетерогенность. В отличие от традиционных методов, таких как микроскопия или культура клеток, проточная цитофлуориметрия позволяет провести мультипараметрическое анализирование, то есть оценить несколько характеристик клеток одновременно, что значительно расширяет возможности исследования.
Заключение

Проточная цитофлуориметрия представляет собой один из самых мощных и универсальных методов анализа клеток, позволяющий исследовать их характеристики и функциональное состояние с высокой точностью и многопараметричностью. Этот метод открыл новые возможности в области медицины и биотехнологии, предоставив ученым и врачам инструменты для диагностики и мониторинга различных заболеваний, включая онкологические и инфекционные заболевания, а также для анализа клеточных процессов на молекулярном уровне. Проточная цитофлуориметрия сыграла важную роль в развитии таких направлений, как иммунология, клеточная терапия, генетика и биотехнология.