Глава диплома по медицине на тему Исследование полярности адгезивных свойств биомембран, изготовленных из перикарда для реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии

1. Материалы из перикарда в реконструктивной хирургии, биопротезировании
А) фиксированные глутаровым альдегидом (ГА), другие способы фиксации, смысл фиксации.
Согласно исследованиям Leigh G. Griffiths с соавторами (2008), бычий перикард (БП) является важным биоматериалом, используемым для производства сердечных клапанов, фиксированных в глутаровом альдегиде. БП имеет относительно низкое содержание клеток и обилие внеклеточного матрикса.
По данным А.А.Венедиктова (2014), использование глутарового альдегида (ГА) в качестве фиксатора биопротезов и матриц доставки лекарств пересматривается. До сих пор изучается химизм образования поперечных сшивок ГА и его влияние на биологические функции ряда протезов, таких как ткань клапанов сердца, сосудистые трансплантаты, заплаты из ксеноперикарда, трансплантаты сухожилий и матриц доставки лекарств. ГА является важным реагентом в области биомедицины, широко используется в качестве сшивающего агента для подготовки биопротезов, таких как клапаны сердца, сосудистые трансплантаты, эластические хрящи, ксеносухожилия и искусственная кожа, для фиксации клеток, иммобилизации ферментов и для сшивки белков и полисахаридов в препаратах контролируемой доставки препаратов. С появлением исследований, посвященных консервирующим свойствам ГА в 1969 г., реагент был успешно использован при подготовке биопротезов клапанов сердца. За последние 45 лет тысячи пациентов получили биоклапаны, фиксированные в ГА. Крупнейшие мировые компании («Edwards Lifescines», «Medtronic», «Sorin Group», «Vascutek Terumo Company» и другие) и по сей день используют ГА в качестве стабилизатора биоткани для изготовления биотрансплантатов и даже живой ткани во время проведения операции. Такая ткань искусственного клапана сердца гарантирует пациенту высокое качество жизни. ГА-сшивки в коллагеновых тканях значительно снижают скорость биорезорбции ткани, что делает её биосовместимой и нетромбогенной при сохранении анатомичной целостности, прочности и гибкости. Другие альдегиды являются менее эффективными в формировании химически, биологически и термически стабильных поперечных связей. Ткани, сшитые ГА сохраняют упруго-деформативные свойства структуры фибриллярного коллагена, что делает их пригодными для биопротезирования. Среди альдегидов, которые могут быть использованы для сшивки белковой матрицы, ГА имеет преимущество, т.к. он реагирует достаточно быстро, может охватывать различные расстояния между молекулами белка, а также может вступать в реакцию с большим количеством доступных аминогрупп в молекуле. Это приводит к более плотно сшитой структуре. ГА используется чаще всего в качестве сшивающего агента, нежели любой 23 другой реагент, поскольку это дешевле, доступнее и он легче растворяется в воде. Водные растворы альдегида состоят из смеси свободного альдегида, моно- и дигидратированных молекул ГА, мономерных и полимерных циклических гемиацеталей и др, ненасыщенных полимеров. В растворе свободный ГА, циклический гемиацеталь и олигомеры находятся в равновесии друг с другом. Содержание свободного альдегида в растворе ГА как правило, не более чем 4%. Скорость полимеризации ГА в водном растворе зависит от концентрации, рН и температурных циклов. Водный ГА может полимеризоваться при щелочных рН до выхода непредельных продуктов Поперечные сшивки в меж- и внутримолекулярных взаимодействиях образуют ковалентные связи. Это может происходить двумя путями: формирование основания Шиффа по реакции альдегидной группы с аминогруппой лизина или гидроксилизина или альдольной конденсации между двумя соседними альдегидами. Связь основания Шиффа не очень стабильна, в то время как продукт альдольной конденсации стабилен. ГА не только взаимодействует с аминогруппами, но также может реагировать с карбокси-, амидо- и другими группами белков. Ряд активности ГА с определенными соединениями выглядит следующим образом: первичные амины> пептиды> гуанидины> вторичные амины> гидроксильные группы. По сравнению с формальдегидом и другими альдегидами, поперечные сшивки являются более стабильными, т.к. ГА вступает в реакцию с белками, такими как альбумин и коллаген, в том числе и мукополисахаридами, в том числе, гепарином. ГА широко используется в качестве сшивающего агента для изготовления клапанов из ткани бычьего перикарда или обработки свиных аортальных комплексов и клапанов. За последние 45 лет эти клапаны были имплантированы тысячам пациентов с очень высокой степенью клинического успеха. По сравнению с механическими клапанами, клапаны, обработанные ГА, имеют то преимущество, что они являются биосовместимыми, нетромбообразующими и не разрушают клетки крови, то есть не требуют антикоагулянтной терапии после имплантации. Ткань клапанов также обладает хорошими гемодинамическим свойствами, аналогичными свойствам живой ткани. Использование ГА оказалось успешным в снижении механической и структурной деградации клапанов, а также в снижении послеоперационной инфекции. Стабилизация ГА выполняет следующие функции: 1) является эффективным стерилизатором в комбинации с выдержкой в формальдегиде после фиксации, 2) уменьшает антигенность белка соединительной ткани, 3) влияет на механические свойства ткани. Концентрации ГА, которые используют для обработки ткани клапанов колеблется от 0,2 до 0,6%. Более низкие концентрации альдегидов являются неэффективными стерилизаторами, особенно в отношении некоторых видов микобактерий. Более высокие концентрации альдегидов могут сделать ткань слишком жёсткой. Условия фиксации, такие как чистота, концентрация, температура, рН и степень воздействия альдегида определяют тип и степень сшивки и в результате конечные свойства материала. Хотя метод изготовления ткани клапанов с использованием ГА, как правило, удовлетворителен, были и неудачи. Возможные причины неудач заключаются в следующих основных моментах — разрыв поперечных связей, поглощение белков плазмы, гидролиз коллагена коллагеназой, механические поломки фибрилл коллагена и иммунологические реакции. Однако нет никаких доказательств того, что можно было бы отнести эти проблемы к методу сшивания ткани с использованием ГА. Водные растворы ГА являются сложными, способными претерпевать различные типы реакций. Все подобные реакции с участием ГА могут способствовать изменению качества фиксации. Поэтому нужны более фундаментальные исследования по методам фиксации белков с использованием ГА для выяснения природы реакций, которые могут пролить свет на причины выхода из строя ткани клапанов. Соединения полиэпоксидов активно используются как агенты, образующие в ткани поперечные сшивки. Они, как сообщается, обеспечивают более выраженный антикальциевый эффект по сравнению с ГА. Непосредственная роль ГА в процессе кальцификации является неопределенной, поэтому преждевременно делать вывод, что эпоксисоединения будет работать лучше, чем ГА, не правильно. Сшивки ГА не могут быть пригодны для материалов, где происходит взаимодействие и инфильтрации в толщу клеток и для обработки хирургических ран такие материалы не годны. С другой стороны, если определенные коллагеновые структуры остаются нетронутыми после имплантации в ткань, то отказ имплантатов вследствие клеточного вторжения может быть предотвращен путем сшивки ГА. Было изучено влияние сшивки ГА на иммунологический ответ. Антигенность ткани перикарда, фиксируемой в 0,2% ГА и в 1% ГА, изучали на кроликах. Было обнаружено, что ткани, более сильно сшитые ГА, показали меньше антигенности. ГА, будучи универсальным сшивающим агентом, имеет большое значение в подготовке биологических протезов. Излишне говорить, что остаточный ГА в имплантатах вреден, и достаточно, проявляя осторожность, удалить непрореагировавший ГА до имплантации, чтобы снизить токсичность. Аминокислоты, такие как L-глутаминовая кислота и глицин были использованы, чтобы нейтрализовать остаточный ГА, а также активные концы альдегида в ткани матрицы после сшивания. Эти альдегид-обработанные материалы показали низкую цитотоксичность в клетках в культуре. Эти результаты также были обнаружены в методах по эндотелизации ткани in vivo. Эффективность промывки биопротезов и важность носителей были должным образом подчеркнуты в литературе, это устранило бы по крайней мере первичный цитотоксический эффект ГА. Различные методы фиксации были изучены для того, чтобы преодолеть некоторые из неблагоприятных последствий сшивания ГА на механические свойства ткани. Они показали очень обнадеживающие результаты. Были подготовлены ГА-фиксированные ткани с механическими свойствами напоминающие натуральные ткани. Однако наличие таких методов, которые смогли бы преодолеть такие проблемы, как разрыв и кальциноз биопротезов, в долгосрочной перспективе еще предстоит выяснить. Были предложены альтернативные методы зашивки ткани, чтобы преодолеть некоторые из проблем, как считается, связанных со сшиванием ГА. Полиэпоксиды, глицерол, карбодиимиды, и т.д. были изучены в качестве сшивающих агентов вместо ГА. Обработка полиглицидиловым эфиром и сшивка ГА, как сообщается, механически эквивалентны при изготовлении биопротезов из бычьего перикарда. Хотя створка свиного аортального клапана, фиксированная полиглицидиловым эфиром, показала меньше кальцификации, чем ГА-фиксированные имплантаты в исследованиях подкожным оперированием, они также показали не очень хорошие результаты в сопротивлении ферментативной деградации. Таким образом, у ГА-фиксированных биопротезов, похоже, много достоинств по сравнению с недостатками, которые связаны с этим реагентом в качестве потенциального сшивающего агента. Более фундаментальные исследования по химии сшивки белка с использованием ГА может пролить свет на некоторые проблемы, связанные, как считается в настоящее время, с этим реагентом.
Согласно данным Leigh G. Griffiths с соавторами (2008), в настоящее время изучают различные методы обработки тканей, экстракции белка и фракционирования для получения высококачественных 2-DE водных и