Курсовая работа по биотехнологии на тему Технология получения γ-аминомасляной кислоты биотрасформацией L-глутаминовой кислоты

Введение
Аминомасляная кислота – это важнейший тормозной нейромедиатор центральной и периферической нервной системы. Выделение ГАМК в организме происходит из глутаминовой кислоты, после того как проходит стадии декарбоксилирования и переаминирования в глутамат и янтарный полуальдегид. ГАМК приводит к гиперполяризации постсинаптической мембраны, что способствует снижению нейрональной активности клетки.
ГАМК-ергическая система участвует в формировании эмоционального поведения, обработке информации и формировании осцилляторной активности. В развивающемся мозге она обеспечивает важные возбуждающие процессы, что необходимо для развития нервной системы [1].
Цель исследования заключается в разработке подходов по технологии получения γ-аминомасляной кислоты биотрасформацией L-глутаминовой кислоты.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. На основе литературных источников определить специфику и технологии получения ГАМК
2. Провести анализ производства ГАМК
3. Выявить факторы, влияющие на производство γ-аминомасляной кислоты
4. Разработать требования к обеспечению технологического производства на примере биотрасформацией L-глутаминовой кислоты.  
Характеристика целевого продукта
ГАМК действует на две основные группы рецепторов – ионотропные и метаботропные ГАМКВ.
ГАМКА состоят из нескольких субъединиц, сгруппированных в несколько классов: α, β, γ, δ, ε, π и σ. Комбинации этих субъединиц дает множество изоформ рецепторов с различной специфичностью и скоростью активации [2].
ГАМК-ергическое торможение может принимать различные формы. В зависимости от того, какие клетки (возбуждающие или тормозные) тормозятся, результатом является повышение или понижение возбудимости группы нейронов [3].
РасположениеГАМК-ергическихсинапсов в постсинаптических клетках также имеет большое значение[4].
Юджин Робертс и Дж. Авапара впервые независимо друг от друга идентифицировали и описали ГАМК в мозге в1950 году. В то время ее функция не была известна, но первоначально предполагалась[5, 6].
Впервые доказательством того, что γ-аминомасляной кислота также может является нейротрансмиттером было открыто в результате исследований рецепторов растяжения у раков, которые показали, что γ-аминомасляная кислота подавляет всплески спонтанного разряда[7, 8]. Совсем недавно ряд электрофизиологических и биохимических экспериментов показал, что γ-аминомасляная кислота действует как нейротрансмиттер[9-11].
ГАМК в изобилии присутствует в мозг млекопитающих, а разнообразные ГАМК-ергические интернейроны распределены в нескольких областях мозга [12, 13]. 
Химическое строение
Кислота глутаминовая

Рисунок 1 – кислота глутаминовая
Кислота гаммааминомасляная (аминалон)


Рисунок 2 - Кислота гаммааминомасляная

Гамма-аминомасляную кислоту получают щелочным гидролизом α-пирролидона и последующим осторожным подкислением образовавшейся соли до свободной γ-амино-масляной кислоты:

 
Физико-химические свойства
Кислота глутаминовая - Белый кристаллический порошок с едва ощутимым запахом. Тпл не ниже 190°С, [α]D 20 от +30,5 до +33,5°. Растворим в горячей воде, нерастворим в спирте и эфире
Кислота гаммааминомасляная (аминалон) - Белый кристаллический порошок со слабым специфическим запахом. Тразл = 200–205°С. Легко растворим в воде, очень мало – в спирте

 
Биологические свойства ГАМК
ГАМК представлены противоположными аспектами ее эффектов в нервной систем как человека, так и более примитивных существ. Вещество является одновременно основным источником энергии для всех типов нейронов и главным тормозным нейромедиатором центральной нервной системы человека.
Около 99% всей ГАМК организма образуется и используется при окислении глюкозы в углекислый газ и воду внутри митохондрий клеток. Поэтому из-за параллельного использования ГАМК в качестве источника энергии ее оказывается много во всех тканях нервных клеток [14]. Именно поэтому ученые долгое время не могли поверить в то, что это вещество также выполняет функцию и главного тормозного медиатора ЦНС. Из всех нейронов ЦНС около 40% используют ее в качестве тормозного нейромедиатора: в результате взаимодействия ГАМК с белками-рецепторами в мембране постсинаптического (принимающего) нейрона открываются каналы, пропускающие внутрь клетки отрицательно заряженные ионы хлора, избыток которых находится в межклеточной жидкости. Проникновение хлора вызывает в нервной клетке состояние гиперполяризации, то есть торможения.
В качестве тормозного нейромедиатора ГАМК синтезируется исключительно внутри пресинаптических окончаний нервных клеток за счет декарбоксилирования глутаминовой кислоты ферментом - глутаматдекарбоксилазой.
Энергетические процессы в клетках не связаны c синтезом ГАМК в пресинаптических окончаниях нервов. Функционирование систем внимания и двигательного контроля основано, в первую очередь, на деятельности ГАМК в качестве нейромедиатора. ГАМК участвует также в регуляторной деятельности сенсорных сигналов, двигательной активности и процессах формирования памяти.
Тонкий баланс между глутаматом – главным возбуждающим нейромедиатором и ГАМК – главным тормозным нейромедиатором обеспечивает нормальное функционирование ЦНС.
ГАМК-нейроны по сравнению с глутамат-нейронами медленнее созревают и легче повреждаются при травмах, гормональных сдвигах, старении. Нарушение баланса между процессами возбуждения и торможения приводит к ухудшению работы психики. Как правило, баланс сдвигается в сторону уменьшения торможения, что проявляется в синдроме дефицита внимания и гиперактивности, нарушениях сна и повышенной тревожности вплоть до эпилепсии [15].
Если принимать ГАМК в виде таблеток, то около 10 % этого вещества проходит в мозг через гематоэнцефалический барьер и выполняет в основном питательную функцию нейронов, улучшая их общее состояние. Торможения, как правило, не наблюдается при систематическом введении ГАМК, а происходит адекватное и правильное питание всего мозга и всех нервных клеток организма. Нейроны воспринимают ГАМК в качестве «хорошей еды» [15].
В этом проявляется ноотропное действие ГАМК. Отметим, что ноотропы улучшают общее состояние нервной системы и высшие психические функции мозга: память, мышление, качество обучения. На здоровый мозг такие вещества заметно не действуют.
Истинный ноотроп начинает “работать” только при хроническом применении его от 2-х и более недель. Таким образом, в фармпрепарате “Аминалон” ГАМК проявляет свойство истинного ноотропного соединения.
Среди них ГАМК-ергическая сигнализация важна для обработки информации в первичной зрительной и соматосенсорной коре [16−18].
γ-аминомасляная кислота является основным нейротрансмиттером проекционных нейронов в базальных ганглиях, составляет более 90% от общего
количества нейронов в популяции [19]. Таким образом, ГАМК-ергические базальные ганглии могут контролировать двигательные зоны ствола головного мозга, таламуса и коры [20−22].
ГАМК синтезируется через метаболические пути, направленные на производство и подержание ее внутриклеточного запаса. Основным предшественником для синтеза ГАМК является глюкоза, хотя пируват и другие аминокислоты (далее – АК) могут служить предшественниками.
На первом этапе образуется глутамат. Затем декарбоксилаза глутаминовой кислоты (далее - GAD) катализирует декарбоксилирование глутамата с образованием ГАМК [23].
Были выделены и секвенированы участки ДНК, кодирующие две изоформы GAD человека − GAD65 и GAD67; ген GAD65 кодирует полипептид с молекулярной массой 65 кДа и длиной 585 аминокислотных остатков, а GAD67 – кодирует полипептид 67 кДа, состоящий из 594 аминокислотных остатков. Эти две изоформы GAD отличаются по своему распределению в нейронах, так как GAD67 присутствует во всех частях нейрона, в то время как GAD65 более многочисленна в терминалях аксона.
В головном мозге почти весь GAD67 присутствует в виде холофермента– активной формы, насыщенной кофактором пиридоксальфосфатом.
В отличие от GAD67, только около половины GAD65 присутствует в активной форме. Обе формы синтезируются в цитоплазме в виде растворимых гидрофильных молекул.
Затем GAD65 подвергается поэтапным посттрансляционным модификациям в NH2-концевом домене, становится гидрофобным, и обратимо прикрепляется к мембране синаптических везикул в нейронах. Скопления GAD65 также обнаруживаются в области комплекса Гольджи нейронов. GAD67 в нейронах обнаруживается в большей части цитоплазмы и проксимальных дендритах, но также в терминалях и области комплекса Гольджи [24].
Как и другие классические непептидные нейротрансмиттеры, ГАМК упаковывается в синаптические везикулы для экзоцитоза. Транспорт ГАМК из цитоплазмы в синаптические везикулы осуществляется двумя белками везикулярной мембраны: вакуолярной Н+АТФазой, которая создает электрохимический градиент протонов [25−27] и вакуолярным транспортером ГАМК (далее – vGAT), он же вакуолярный ингибитор транспортер аминокислот (далее - VIAAT). Вакуолярный просвет в обмен на протоны, делая цитоплазматический неротрансмиттер доступным для поглащения против градиента концентрации ГАМК [28].
VIAAT принадлежит к семейству транспортеров SLC32, состоит из девяти трансмембранных доменов и не связан с везикулярными транспортерами SLC17 (глутамат) или SLC18 (ацетилхолин и моноамины) [29].
Как и в случаях большинства нейротрансмиттеров, экзоцитоз ГАМК из синаптических везикул инициируется деполяризацией пресинаптической мембраны через открытие потенциал-зависимых кальциевых каналов, локализованных в области плазматической мембраны, прилегающей к синаптическому пузырьку (везикулам), что локально повышает концентрацию цитозольного кальция и цитоскетеную структуру, стимулирует высвобождение везикул из цитоскелета, увеличивая количество везикул, доступных для слияния с плазматической мембраной [30].
После проникновения в синаптическую щель ГАМК связывается с целевыми рецепторами в постсинаптических клетках. Действие ГАМК в синапсе возвращается в нервные окончания и глиальные клетки через ГАМК-транспортеры, которые являются мембраносвязанными белками, участвующие в транспорте сигнальных молекул (например ионы и различные аминокислоты. Транспортер ГАМК (далее - GAT) млекопитающих подразделяется на четыре подтипа. Подтипы GAT1 и GAT3 составляют основную долю в центральной нервной системе.
В частности, GAT1 в основном экспрессируется в нейронах мозга [31], особенно в пресинаптических терминалях аксона, и в следовых количествах в ганглиях [32], в то время как GAT3 в основном локализуется в перисинаптических астроцитах [33].
GAT2 / BGT1 не обнаруживается в мозге, но в печени, почках, твердой мозговой оболочке и ГЭБ он экспрессируется [34].
GAT1 и GAT3 играют разные роли в синаптической функции: первый ингибирует выход ГАМК из синаптической щели во время фазной синаптической передачи, а второй регулирует концентрацию ГАМК в окружающей среде, которая опосредует тоническое торможение [35].
Деградация ГАМК в глии происходит под действием ГАМК-трансаминаз, которые подвергаются траснаминизации в присутствии α-кетоглутарата, приобретают аминогруппы и превращаются в глутамин, который транспортируется к нейронам, образуя янтарный полуальдегид. Янтарная полуальдегиддегидрогеназа окисляет янтарный полуальдегид с образованием сукцината, который, в свою очередь, завершает цикл Кребса [22, 36].
 
Получение ГАМК
Известны следующие химические методы синтеза ГАМК
- Garmaise et al, Canad. J.Chemistry, 1956, 34, 742-748;
- Авторское свидетельство СССР №452196.
Недостатками этого способа являются высокая стоимость пирролидона, жесткие условия синтеза и сложность гидролиза остаточного пирролидона в организме.
Продукты, обогащенные ГАМК, могут также использоваться в медицинских целях. Известны различные продукты растительного происхождения, обогащенные ГАМК. Например, листья чая (заявка Японии 9-205989), штаммы Bact. cadaveris ATCC 9760 и E. coli ATCC 9637 культивировали в течение 30 часов, и в культуральной среде накапливалось до 4 г/л ГАМК. Продукты отделяли от выделенной культурной среды ионообменной хроматографией с использованием Diaion SKI (тип Н+) при pH 2.0. Выход кристаллического продукта из культуральной среды составлял 35%.
Недостатками этого метода являеются низкий выход ГАМК и длительное время процесса.
Листья кофе (заявка Японии 8-173111), крестоцветные растения и их сок (европейская заявка ЕР 1082911 А2), нитевидные грибы (JP 2000060536 A2), порошок или сок крестоцветных растений (JP 2001136929 А2) и т.д.
Описаны микробиологические методы получения ГАМК с использованием бактерий Е.coli ВКПМ В-7460 и ВКПМ В7452, содержащих плазмиды с генами глутаматдекарбоксилазы (патент РФ №2143002), Bad. cadaveris ATCC 9760 (JP69-01197), Е. coli ATCC 9637 (JP70-15437) и Arthrobacter simplex ATCC 15799 (JP69-01196).
Известно, как микробные клетки, включая Е. coli, ферментативно декарбоксилируют L-глутаминовую кислоту для получения ГАМК, которые
содержат L-глутаматдекарбоксилазу (GAD, ЕС 4.1.1.15) (Патент Японии N 69 01196; Губарев E.М. и др. Биохимия. 1960. Т. 25, N 2, с. 261-263), а также иммобилизованная GAD (А.с. СССР N 799318).
Недостатками этого метода являются низкая глутаматдекарбоксилазная активность клеток и дополнительная процедура выделения и очистки GAD для иммобилизации.
Существует метод получения ГАМК путем декарбоксилирования L-глутаминовой кислоты клетками бактерии Arthrobacter simplex ATCC 15799 (Патент Японии 69 01196). Согласно этому методу, бактерии культивируют в течение четырех дней при температуре 30oC, pH 7,0 в среде, содержащей 1% L-глутаминовой кислоты, 1% глюкозы, 0,05% фосфата калия двузамещенного, 0,025% сульфата магния семиводного, 0,2% сульфата аммония, 0,3% дрожжевого экстракта и 0,3 % мела. Концентрация биомассы в культуральной среде в конце процесса составляет 6 мг/мл. Для получения ГАМК 3 г высущенной биомассы, обработанной ацетоном, добавляют к водному раствору L-глутаминовой кислоты (10 г/300 мл) при pH 5,0 и температуре 37oC. Процесс прокаливания проводят в течение двух часов до полного превращения L-глутаминовой кислоты в ГАМК при этом исходное значение pH поддерживается автоматическим добавлением 3н.HCL. В конце процесса реакционную смесь освобождают от биомассы и выделяют ГАМК путем добавления этанола. В результате получается 7 г ГАМК, т.е. из 1 г высушенного ацетонированного порошка синтезируется 2,3 г ГАМК.
Недостатками этого метода являются низое накопление биомассы, длительный период роста и высокий расход биомассы для производства ГАМК (0,43 г сухой биомассы на 1 г продукта) из-за низкой глутаматдекарбоксилазной активности используемых штаммов.
Способ биотрансформации L-глутаминовой кислоты или ее солей в присутствии бактериальной биомассы с активностью декарбоксилазы глутаминовой кислоты для получения γ-аминомасляной кислоты, а затем выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что используют штаммы бактерий Escherichia coli ВКПМ В-7460 или Escherichia coli ВКПМ В-7452.
 
Биотрансформация аминокислот
В 1908 году японские ученые обнаружили, что L-глутаминовая кислота в морских водорослях усиливает вкус. Промышленное производство L-глутаминовой кислоты из кислых гидролизатов пшеничного глютена и соевого белка началось в Аджиномото в 1909 году.
В 1957 году компания Seiwa Hakko обнаружила, что Corynebacterium glutamicum накапливает L-глутаминовую кислоту в среде, содержащей сахар.
В клетках C. glutamicum L-глутаминовая кислота образуется путем трансаминирования 2-оксоглутаровой кислоты, образующейся при окислении изимоновой кислоты в цикле Кребса. У штаммов дикого типа окисление продукта цикла Кребса - дикарбоновой кислоты - жестко регулируется (Рисунок 3).Исследования генома C. glutamicum Исследования генома C. glutamicum и способов регуляции активности ферментов привели к открытию следующих новых штаммов:
1) Повышенное выделение глутаминовой кислоты в среду роста;
Количество глутамата в культуральной среде сильно зависит от скорости секреции и, следовательно, от проницаемости цитоплазматической мембраны. Проницаемость мембраны может варьироваться. Например, биотин, жирные кислоты или глицерин (в случае автотрофии с жирными кислотами или глицерином, соответственно) ограничивают для увеличения проницаемости. Добавление пенициллина в среду также увеличивает проницаемость клеточной стенки, поскольку пенициллин ингибирует образование клеточной стенки.
2) Изменяется регуляция активности некоторых ферментов, участвующих в биосинтезе L-глутаминовой кислоты;
Активность оксоглутаратдегидрогеназы значительно ниже у коммерческих штаммов C. glutamicum. L глутаматдегидрогеназы (KМ различаются примерно в 70 раз, Vmax – примерно в 150 раз).
3) Активируются различные метаболические пути побочных продуктов.
Среди наиболее важных анаплеротических реакций - карбоксилирование фосфоенолпирувата и активация глиоксилатного цикла (у растений и бактерий). Обе реакции приводят к образованию оксалуксусной кислоты, предшественника лимонной кислоты, и эти реакции также могут привести к включению продуктов гликолиза дикарбоновых кислот (C2) в цикл лимонной кислоты. Фосфоенолпируваткарбоксилаза использует биотин в качестве кофермента, и активность фермента можно регулировать путем изменения количества биотина. Активность многих ферментов, вовлеченных в глиоксилатный цикл, может быть искусственно изменена, поскольку она зависит не только от метаболитов и конечных продуктов, но и от концентрации NH4+ и NAD+/NADH. У штаммов, продуцирующих глутаминовую кислоту, выход продукта может быть увеличен путем генетических манипуляций.
В настоящее время геном C. glutamicum полностью расшифрован Геном C. glutamicum полностью расшифрован и активно изучается. В частности, изучается зависимость выхода продукта от вставки в геном мультикопийной кассеты, несущей ген глутаматдегидрогеназы.
Сырьем для производства глутамата являются меласса и гидролизаты крахмала. В оптимальных условиях культуры продуктивные штаммы C. glutamicum перерабатывают до 60-70% исходного материала. Источниками азота являются соли аммония и аммиак. При выборе условий роста следует оптимизировать концентрацию биотина в среде и поддерживать рН среды в диапазоне 7,0-8,0.
Аэрация клеточной культуры очень важна для синтеза глутамата. Оптимальное значение kd составляет 3,5*10-6 моль кислорода/(атм мин мл).
Ферментацию в промышленных масштабах проводят в реакторах с рабочим объемом до 500 м3. Как правило, сначала проводят предферментацию, а затем ферментацию воздушно-проточным способом. Чтобы избежать ингибирования катаболитами, после образования достаточного количества клеток (14 ч роста в среде поддерживают постоянный уровень глюкозы, не превышающий 0,5%. После удаления клеток ультрафильтрацией глутамат выделяют из культуральной жидкости методами ионообменной или абсорбционной хроматографии (150 г/л через 60 ч роста) (рис.4).

Рисунок 3 – Биосинтез и штаммы-суперподуценты глутамата

Рисунок 4 – Ферентация и первичная переработка. Усиление секреции
Глутаминовая кислота не является незаменимой, но широко используется в различных областях промышленности. Наиболее часто глутаминовая кислота в виде мононатриевого глутамата используется в качестве ароматизатора и консерванта в пищевой промышленности.
Приоритет в производстве этой аминокислоты, несомненно, принадлежит Японии. Крупнейшим производителем глутамата натрия является компания Адзиномото. В биосинтезе глутаминовой кислоты используются Corynebacterium glutamicum ВНИИгенетика-490, Corynebacterium glutamicum 541P и Brevibacterium species 22. Глутаминовая кислота может производиться микроорганизмами в двух формах: - производство глутамата путем восстановительного аминирования α-кетоглутаровой кислоты:


– переаминированием α-кетоглутаровой кислоты с участием свободных аминокислот микробной клетки в присутствии фермента аминотрансаминазы:

В обоих случаях предшественником глутаминовой кислоты является α-кетоглутаровая кислота, которая образуется в результате реакций, происходящих в цикле трикарбоновых кислот. Для интенсивного синтеза глутамата требуются мутантные штаммы микроорганизмов, дефектные в ферментной системе, преобразующей α-кетоглутарат в сукцинат (дефект в образовании α-кетоглутаратдегидрогеназы). В отличие от биосинтеза лизина, концентрация биотина в среде при биосинтезе глутамата не должна превышать 2-5 мкг/л. В противном случае происходит интенсивное накопление других аминокислот (аланина, аспарагина, лизина и сукцината). При более высоких концентрациях биотина синтез биомассы увеличивается, а накопление глутаминовой кислоты уменьшается. Максимальное образование биомассы не совпадает с максимальным биосинтезом глутамата, поскольку требования к биотину у этих процессов разные.