Биотехнология в ветеринарии

Введение Законом Российской Федерации «О ветеринарии» определены ос-новные задачи ветеринарной медицины «в области научных знаний и практической деятельности, направленные на предупреждение бо¬лезней животных и их лечение, выпуск полноценных и безопасных в ветеринарном отношении продуктов животноводства и защиту насе-ления от болезней, общих для человека и животных». Решение целого ряда этих задач осуществляется методами био-технологии. Определение биотехнологии в довольно полном объеме дано Европейской биотехнологической федерацией, основанной в 1978 г. По данному определению биотехнология - это наука, которая на основе применения знаний в области микробиологии, биохимии, генетики, генной инженерии, иммунологии, химической технологии, приборо- и машиностроения использует
2
биологические объекты (микро¬организмы, клетки тканей животных и растений) или молекулы (нук¬леиновые кислоты, белки, ферменты, углеводы и др.) для промыш¬ленного производства полезных для человека и животных веществ и продуктов. Современные биотехнологические процессы основываются на методах рекомбинантных ДНК, а также на использовании иммобилизованных ферментов, клеток или клеточных органелл. Современную биотехнологию можно рассматривать как науку о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и применения генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов животноводства. Глава 1. Ветеринария и биотехнологические производства 1.1. Производство лекарственных средств Такое применение биотехнологических методов не является уникальным для ветеринарной медицины, так как большая часть исследований и биотехнологических производств направлены на создание препаратов для людей. Но часть так называемой «красной» биотехнологии направлена на получение лекарственных субстанций и препаратов для животных. В их число входит широкий спектр лекарственных средств: антибиотики, витамины, противовирусные средства, противовоспалительные препараты и т.д. [2, 3, 4, 8] Для производства лекарственных средств методами биотехнологии зачастую используется бактериальная ферментация. Суть этого метода - наработка большого количества неочищенного от примесей действующего вещества (или его предшественника) с последующей его очисткой. Чтобы наработать большое количество необходимого вещества необходимо создать такой штамм-продуцент, который позволит произвести достаточное количество в промышленных масштабах. Одним из самых удобных объектов для создания суперпродуцента считается бактерия Escherichia coli, которая имеет достаточно простой набор генов в своей плазмиде (кольцевой молекулы ДНК). Чтобы получить суперпродуцент создается отдельная плазмида, содержащая ген, отвечающий за производство целевого препарата. Помимо этого, плазмида должна содержать вспомогательные последовательности нуклеотидов (энхансер, сайленсер, промотор и т.д.), которые позволят усилить производство целевого гена [2, 4, 6, 12]. Так же целесообразно добавлять последовательности, которые помогут идентифицировать те бактерии, которые содержат необходимый для производства ген. Чтобы внедрить плазмиду внутрь
3
клетки используется метод бактериальной трансформации, который не обеспечивает стопроцентную эффективность. 1.2. Производство биомассы. Широкое распространение в сельском хозяйстве и животноводческой отрасли получили кормовые белковые добавки, которые выпускаются в виде концентрированного продукта [2, 3]. Получаемый кормовой белок бывает трех типов: • Кормовые дрожжи - сухая концентрированная биомасса гидролизированных клеток; • Кормовые бактерии - биомассы с большим содержанием серосодержащих аминокислот; • Белковый концентрат метанового происхождения - добавка в виде бактериальной биомассы, полученная путем микробиологического синтеза природного газа [7]. Общая принципиальная схема производства кормовых белковых продуктов достаточна проста и представлена на Рисунке 4. Подготовительные стадии включают в себя технологические процессы: • Стерилизация среды; • Подготовка и стерилизация газов (воздуха); • Подготовка посевного материала; • Приготовление биокатализатора, засевного материала; • Предварительная обработка сырья. Ключевой стадией производства является биотехнологическая, основным процессом которой является ферментация. Она может проводиться в анаэробных и аэробных условиях, периодическим или непрерывным способом. Технология получения корма зависит и от метода культивирования, которое может быть представлено глубинным культивированием, глубинным гетерофазным культивированием и поверхностным культивированием [13, 14]. Глава 2. Прикладные биотехнологии в ветеринарии 2.1. Трансплантация эмбрионов
4
Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных - биотехнологический метод воспроизводства, позволяющий увеличить темпы воспроизводства и повысить эффективность племенной работы. Наиболее приемлемы для трансплантации эмбрионов малоплодные виды животных: коровы, лошади, овцы. В мировой практике животноводства метод трансплантации эмбрионов в большей степени применяется в молочном и мясном скотоводстве. Используя реципиентов для пересадки эмбрионов, полученных от одной отобранной коровы - донора, можно увеличить число ее потомков в десятки и сотни раз. Теоретически от генетически выдающейся коровы-донора за всю ее жизнь можно получить не менее 500 телят [5, 15]. В трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота сделан огромный прогресс, вследствие чего этот метод занял прочное место в современных программах селекции. Метод трансплантации вместе с искусственным осеменением рассматривается как основа современной биотехнологии воспроизводства высокопродуктивных племенных животных. Технология трансплантации эмбрионов включает ряд последовательных этапов: отбор доноров; проведение суперовуляции у доноров; отбор производителей и осемение доноров; извлечение эмбрионов и их оценка; культивирование или замораживание эмбрионов; отбор и подготовку реципиентов; пересадку эмбрионов реципиентам; оценку результатов трансплантации [5, 10, 15, 17]. 2.2. Получение трансгенных животных Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удойностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т.д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получить более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и отбора, требующая больших временных и материальных затрат, оказалась тем не менее исключительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения новых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако, после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора становится все труднее. Так, линия с новым «ценным» геном может нести также в «вредные» гены, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенными в том, что новая, улучшенная линия сохранит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно новую стратегию [2, 10, 15]. Успешные эксперименты по введению чужеродных генов в клетки млекопитающих и возможность создания генетически идентичных животных
5
путем переноса ядра из эмбриональной клетки в яйцеклетку с удаленным ядром (перенос ядра, клонирование) позволили включить в хромосомную ДНК высших животных отдельные функциональные гены или целые их кластеры. Используемая стратегия состоит в следующем: 1. Клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки; 2. Оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь (поскольку успешное завершение развития эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно); 3. Отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках; 4. Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию. 2.3. Клонирование животных Под клоном понимают генетически однородных потомков одной исходной особи, образующихся в результате бесполого размножения. Многочисленные потомки исходной особи имеют идентичный генотип. Однако, нужно иметь в виду, что животные, полученные в результате клонирования, не могут образовывать чистые линии, в которых, как известно, отсутствует генетическая изменчивость, и селекция не дает эффекта. Клоны животных отличаются от чистых линий в первую очередь тем, что при одинаковой в обоих случаях фенотипической однородности в чистых линиях все ее гены гомозиготны, тогда как в клонах они в сильной степени гетерозиготны [2, 12]. Для создания генетических копий сельскохозяйственных животных на базе клеточной инженерии разрабатываются методы клонирования: пересадка ядер соматических клеток в энуклеированную яйцеклетку; индуцирование партеногенеза, позволяющего полностью передавать потомкам генотип одного из родителей. Наиболее перспективно клонирование сельскохозяйственных животных путем трансплантации извлеченных из соматических клеток ядер в энуклеированные яйцеклетки. Любая дифференцированная соматическая клетка содержит полный набор генов, свойственных данному животному. Установлено, что карпиотип дифференцированных клеток не отличается от кариотипа оплодотворенной яйцеклетки - зиготы, из которой они произошли. Клонирование млекопитающих путем трансплантации диплоидных ядер в энуклеированную яйцеклетку представляет сложную задачу. Небольшой объем зиготы млекопитающих ограничивает количество вводимого ядерного материала и увеличивает ее повреждаемость при трансплантации чужеродного ядра [2, 6, 12, 15].
6
В 1977 г. исследователи усовершенствовали методику клонирования и впервые получили живых мышей. Они удаляли из оплодотворенных яйцеклеток один из пронуклеусов, а затем инкубировали энуклеированные яйцеклетки с цитохалазином В, который вызывал диплоидизацию оставшегося в яйцеклетке пронуклеуса. По генетическим маркерам было установлено, что одна часть эмбрионов сформировалась путем гиногенеза (при диплоидизации женского пронуклеуса), а другая - путем андрогенеза (при диплоидизации мужского пронуклеуса) [2, 15]. В начале 80-х годов был предложен новый метод слияния клеточных фрагментов с целью пересадки ядер в зиготы мыши. Он состоял из комбинации двух методов - микрохирургического удаления пронуклеусов из оплодотворенной яйцеклетки и введения чужеродных пронуклеусов или ядер 280-клеточных зародышей после их кратковременного культивирования с инактивированным вирусом Сендай [2, 6, 15]. Заключение В настоящее время ветеринарная биотехнология является актуальным предметом исследований, направленных на улучшение здоровья животных, продуктов животноводства, на сохранение биологического разнообразия. Развитие биотехнологии осуществляется в нескольких направлениях, что дает возможность широкого внедрения полученных знаний в генетике, микробиологии, генной инженерии, биохимии, в развитии химических технологий. Поскольку в биотехнологии находят применение научные достижения очень высокого уровня, то это определяет получение разнообразных веществ, соединений из возобновляемых, а, следовательно, доступных, сравнительно дешевых материалов. На сегодняшний день основные направления применения микроорганизмов представлены тремя биотехнологическими процессами: производство биомассы; производственные процессы получения антибиотиков, этанола, органических кислот, др.; процессы переработки органических/неорганических соединений природного или антропогенного происхождения.