Получение рекомбинантного анатоксина альфа-гемолизина золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus). 1) Альфа-гемолизин (Alpha-Hemolysin) 2) Получение РЕКОМБИНАНТНОГО альфа-гемолизин (или любого РЕКОМБИНАНТНОГО белка) 3) Получение анатоксина альфа-г

Введение
В настоящее время международные эксперты и правительства большинства стран рассматривают вакцинопрофилактику как наиболее доступный и экономически эффективный способ снижения детской смертности, увеличения ожидаемой продолжительности жизни и достижения активного долголетия во всех социальных группах развитых и развивающихся стран. В современном обществе защита от биологической опасности, под которой прежде всего подразумевается опасность инфекций, рассматривается как одна из актуальных задач государственной политики раз# витых стран, в т. ч. и России.
Длительное время конструирование вакцин шло по пути идентификации и получения чистых протективных антигенов. Однако созданные с помощью генноинженерных технологий такие антигены оказались малоиммуногенными. Решение этой проблемы, как показывает анализ, лежит в использовании новых иммунологических знаний.
I. Альфа-гемолизин (Alpha-Hemolysin)
Золотистый стафилококк вызывает различные инфекции у человека, включая эндокардиты, остеомиелиты, артриты, раневые сепсисы, кожные абсцессы, маститы, кератиты и является причиной более 40 % случаев госпитальных инфекций [3,6].
• Таксономическое положение и классификация стафилококков. Название стафилококков происходит от греческих слов “staphylоs” – виноград, гроздь и “coccos” – ягода, зерно.
Стафилококки относятся к типу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Bacillales, семейству Staphylococcaceae и роду Staphylococcus. Этот род включает более 35 видов. Клинически значимыми для человека видами стафилококков являются Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus intetrmedius и некоторые другие.
Среди стафилококков выделяют патогенные виды (в частности, S. aureus), условно-патогенные виды (например, S. epidermidis) и непатогенные виды (в частности, S. saprophyticus) [3,4,6].
С точки зрения патогенетических признаков важной является классификация стафилококков по способности продуцировать плазмокоагулазу. По этому признаку стафилококки подразделяются на коагулазоположительные или коагулазопозитивные (к ним относится золотистый стафилококк – S. aureus) и коагулазоотрицательные или коагулазонегативные стафилококки (к ним относятся эпидермальный и сапрофитный стафилококки – S. epidermidis и S. saprophyticus). Внутри вида по чувствительности к бактериофагам S. aureus подразделяется на фагогруппы и фаговары.
II. Получение анатоксина альфа-гемолизина
Для получения анатоксина можно использовать ферментационную наработку штамма E.coli, содержащего рекомбинантную ДНК альфа-гемолизина Staphylococcus aureus с последующим обезвреживанием полученного токсина. Общая схема производства выглядит следующим образом:
• Подготовительная стадия, во время которой происходит подготовка питательных сред, добавок (если используются fed-batch процессы), штаммов микроорганизмов, посевного материала, емкостей и оборудования для ферментационного процесса.
• Стадия ферментации, в процессе которой происходит непосредственно ферментация, начиная от засева инокулята, до момента прекращения ферментационного процесса.
• Разделение жидкости и биомассы, для того, чтобы итоговый продукт, вне зависимости от места его содержания (внутриклеточный или внеклеточный) можно было подвергнуть дальнейшему выделению и очистке.
• Выделение и очистка. На этой стадии происходит сначала выделение целевого продукта из биомассы (лизис клеток) или жидкости (преципитация, хроматография, центрифугирование и т.д.), после чего происходит более тонкая очистка, которая может включать несколько этапов, в зависимости от требуемой итоговой чистоты препарата. Если же продукт не надо выделять (например, если в качестве продукта выступает биомасса клеток, внутри которых находится какое-либо вещество), то он может подвергаться инактивации и прохождению следующих стадий.
• Обезвреживание токсина с последующей очисткой от оставшихся загрязнителей и агентов обезвреживания.
• Формулировка и фасовка – заключительная стадия, во время которой происходит перевод препарата именно в ту форму, которая нужна (выпаривание, кристаллизация, таблетирование и т.д.), после чего препарат фасуют по тарам, в которых он будет представлен в товарном виде [7, 9, 13, 15].
Разберем каждую стадию подробнее, чтобы указать детали получения анатоксина альфа-гемолизина.
1. Подготовительная стадия
Так как для получения альфа-токсина будет удобно использовать E.coli, то все процессы будут рассматриваться с точки зрения ферментации этого микроорганизма.
III. Существующие вакцины альфа-гемолизина
В настоящее время не существует вакцины, которая была бы основана исключительно на анатоксине альфа-гемолизина золотистого стафилококка и успешно применялась бы в любой стране. Существуют наработки, которые отображены в некоторых исследованиях и статьях, посвященные непосредственно альфа-токсину Staphylococcus aureus [1,2]. Так же существуют патенты на получение стафилококковых анатоксинов, но способ получения не относится к работе с рекомбинантной ДНК, а выражен в работе с выращиванием стафилококковой массы, ее последующей нейтрализацией и получением анатоксина, по всей видимости, не только к альфа-гемолизину, но и к другим токсинам [19]. Вакцины, основанные на выращивании массы стафилококков и последующей нейтрализации, вероятно, являются более простыми и дешевыми в производстве, хотя и теряют свою специфичность по отношению к альфа-гемолизину.

Заключение
Гемолизины – это экзотоксины, действующие непосредственно на клеточную мембрану, вследствие чего происходит лизис эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов макрофагов и развивается поражение многих тканей. Действием гемолизина, вероятно, объясняются фатальные исходы многих случаев стафилококковых инфекций.
Кокки – широко распространенная в природе группа шаровид¬ных сапрофитных и реже патогенных бактерий. Они относятся к семействам Micrococcaceae и Deinococcaceae.
Патогенными для животных являются главным образом бактерии родов Staphylococcus и Streptococcus. Обитают они на коже и слизистых оболочках дыхательных, пищеварительных и мочеполо¬вых путей. Многие кокки – представители нормальной микрофло¬ры организма.